Super Mario 64 débute par une lettre de la princesse Peach qui a invité Mario à manger un gâteau qu'elle a préparée dans son château. Cependant, une fois rentré dans le château, Mario découvre que Bowser a fait prisonnière la princesse ainsi que ses serviteurs en utilisant le pouvoir des 120 étoiles du château. La plupart des peintures du château sont des portes vers d'autres mondes, dans lesquels les serviteurs de Bowser gardent les étoiles. Mario cherche ces portes dans le château pour entrer dans ces mondes et récupérer les étoiles. Il obtient l'accès à de nouvelles pièces lorsqu'il obtient des étoiles, et il devra affronter Bowser à trois reprises dans des niveaux spéciaux. Vaincre Bowser les deux premières fois permet à Mario d'obtenir une clef vers un autre niveau du château, tandis que le dernier combat permet de libérer Peach. Peach récompense Mario en lui préparant le gâteau qu'elle lui avait promis.
Super Mario 64 se déroule dans le château de la Princesse Peach, qui se compose de trois étages, un sous-sol, des douves et une cour. La zone à l'extérieur du château est une zone d'introduction dans laquelle le joueur peut expérimenter. Des peintures et des murs secrets éparpillés à travers le château permettent d'entrer dans les niveaux.
